单抗(mAbs)是一种有效的治疗药物，因为它具有高亲和力和靶标特异性，而且具有类药物的特征。针对MHC卵白提呈的多肽肿瘤抗原的单抗，称为TCR-Mimic(TCRm)抗体，是一种新兴的免疫治疗手段，可以识别肿瘤细胞外观低水平表达的多种肿瘤抗原。这种TCRm单抗能够以多种形式用来实现分歧的靶向杀伤，包罗用于ADC和/或ADCC(抗体依靠性细胞毒性)的IgG、BiTEs和CAR-T的配景下。然而，抗体和αβ-TCR在识别其靶标的体式长进化了基本的构造差别，这限制了当前的TCRm手艺(图1a,b)。抗体行使CDR3的多样性和体细胞超突变，经由所有6个CDR环实现对卵白质靶标外观的高亲和力。比拟之下，因为pMHC外观的复合性质，αβ-TCR使用一种更细微的、MHC受限的识别方案(图1a)。TCR首要使用胚系起原的CDR1和CDR2以极低的亲和力与MHC螺旋连系，而CDR3环的聚焦遗传多样性在很大水平上与MHC沟中连系的多肽抗原的‘up-facing’氨基酸残基连系。MHC螺旋识别和多肽专一性之间的这种微妙的能量均衡使TCR可以在称为扫描的过程中精美区域分分歧的自体和异源多肽。抗体连系位点没有进化为pMHC外观的抗原特异性识别。星散与pMHC外观高亲和力和完全多肽选择性连系的MHC限制性抗体是一项难题的手艺挑战，既耗时又得率低。

今朝可用于星散TCRm抗体的手艺不克注释抗体和TCR介导的抗原识别之间的构造能量差别(图1a,b)。TCRm抗体一样经由常规方式星散，如小鼠杂交瘤和噬菌体展示文库手艺。在每种情形下，都必需对每个pMHC靶标进行从头筛选。因为Abs与pMHC上的任何表位连系，与TCR分歧，Abs不会天然倾向于与复合肽和MHC外观连系，这只占可连系的总pMHC外观的一小部门，是以射中率很低。然而，这些方式已经成功地判定了多肽特异性的TCRm抗体。然而，脱靶MHC回响的前景仍然取决于TCRm对接模式是否偏离均衡而且显露MHC螺旋接触的优势(图1b)。TCRm抗体的这种pMHC连系模式能够与MHC螺旋具有相当大的连系能(图1b)，从而使它们易于与健康组织上的自身pMHC发生不需要的回响。

星散TCRm抗体的另一种方式是专注于已知的以“常规的”TCR-like体式与pMHC连系的抗体(图1b)。在这里，尺度将是连系到pMHC雷同于已知的典型的对角线‘萍踪’中看到的大多数α-β TCR与MHC的复合体。这种萍踪的特点在于，来自Vα和Vβ的种系编码的TCR CDR1和CDR2平日与MHC螺旋接触，以竖立MHC特异性，而CDR3环扣问MHC沟的中心是否有连系肽，尽管这有很大的差别。这一总体构造框架为TCRm抗体供应了一种幻想的识别模式，但在实践中，经由前面提到的从头筛选方式很难识别它们。例如，即使已经被竖立为肽特异性的TCRm抗体也能够示意出替代的、不进展看到的连系模式，首要是与MHC螺旋接触，显露出非TCR-like萍踪(图1b)。然而，存在以与TCRs几乎沟通的连系模式与pMHC连系的TCRm抗体的构造例子，这能够被TCRm从新行使。

这里提出了一种快速、集平分离MHC限制性TCRm抗体的策略，方式是使用现有的与pMHC以TCR-like连系的TCRm抗体作为肇端工程模板，然后，经由将文库专门集中在与肽接触的TCRm抗体CDR残基上，同时保留MHC接触，能够选择根基上受MHC限制的TCRm抗体文库(图1c)。然后，这些文库能够在几周内针对统一MHC等位基因呈递的分歧肽进行快速从新选择(图1d)。这里介绍了这些文库的斥地，针对一系列小鼠和人类肿瘤抗原的pMHC特异性的从新设计，以及这些TCRm抗体随后经由ADCC以TCRm-BiTE和CAR-T形式杀死肿瘤细胞的能力。最后，给出了一种从新设计的人TCRm抗体的构造验证，因为这种选择策略，它示意出了对MHC选择性的增加。经由从倾向MHC的模板起头，这项手艺充沛快速，可以对个别患者的新抗原进行实时临床应用。

研究TCRm抗体与小鼠p-MHC分子的现有晶体构造，并判定了一种TCRm抗体25-D1.16(PDB:3CVH)，它以TCR-like的对接模式与OVA/H2-Kb连系，从而显露出幻想的识别机能(图2a)。该抗体与传统的TCR/pMHC对接萍踪显露非常一致，个中CDR3首要(但不完全)集中在多肽上，而CDR1和2则集中在MHC螺旋上。选择25-D1.16作为scFv酵母展示文库的肇端模板。在文库建立之前，在酵母外观展示了25-D1.16 scFv，以验证与OVA/H2-Kb tetramer的连系(图2b)。25-D1.16 scFv显露酵母可被呈现OVA(SIINFEKL)肽的H2-Kb tetramer特异性染色，表明scFv已准确折叠，是构建文库的精巧起点。

在文库设计中，只随机化了25-D1.16 Ab CDR环上与OVA肽接触的氨基酸位置，而不点窜与MHC接触的残基(图2a)。这里是逻辑是，若是随后选择该文库针对除OVA以外的H2-Kb提呈肽，而且抗体的MHC连系残基完整，则该文库将被付与必然水平的H2-Kb倾向。方针是许可对接转移以适应新的多肽互相感化，但仍然受到MHC的限制。经由对25-D1.16-OVA/H2-Kb构造的剖析，在H2-Kb呈递的 OVA多肽的4Å（Å是晶体学、原子物理、超显微构造等常用的长度单元单子，1Å=10^-10m，nm的1/10）内判定了9个抗体残基(图2a)。然后，经由在这9个残基中引入简并的三聚体暗码子突变，竖立了一个多样性约为5×10^8的文库。

作为一个新的靶点，选择了一个表征精巧的小鼠肿瘤抗原Trp2 (SVYDFFVWL) (180-188)，它是由H2-Kb呈递的小鼠B16黑色素瘤表达的。对倾向TCRm scFv文库进行了酵母展示选择，以Trp2/H2-Kb tetramer染色。经由四轮Trp2/H2-Kb选择和一轮OVA/H2-Kb负选择后，scFv文库对Trp2/H2-Kb特异地富集，但对OVA/H2-Kb没有(图2c)。第四轮scFv文库筛选进一步用Trp/H2-Kb tetramer进行FACS分选，以富集高亲和力连系卵白。选择了4个识别Trp2/H2-Kb的独一克隆进行进一步剖析(图S1a和表S1)。因为克隆 13对Trp2/H2-Kb复合体示意出最高的亲和力，是以选择它进行进一步剖析(图S2 a,b)。对Trp2多肽进行了丙氨酸扫描，究竟显露TCRm Ab对中心位置的P5和P6残基具有高度特异性，证实了文库设计保留了亲本TCRm Ab的多肽位置选择性(图2d)。克隆 13，当被变为scFv(图S1b)和IgG(图S1c)重组卵白时，可以以肽剂量依靠的体式与Trp2肽脉冲的H2-Kb+EL4细胞特异性连系，检测到起码的本底连系(图2 e,f和图S1 d,e)。

今朝还没有关于小鼠肿瘤抗原的TCRm的报道，这供应了索求治疗体式的机会，并将克隆13 TCRm抗体作为成像对象测验量化该肿瘤抗原在B16F10细胞上的表达水平。鉴于需要细心定量，使用B16F10靶细胞和表达活化T细胞核因子(NFAT)申报基因的mFcγRIV的小鼠效应细胞来替代ADCC，以最大限度地削减原代细胞ADCC检测的变异性。为了最大限度地提高TCRm抗体的ADCC申报基因活性，生成具有工程化Fc的小鼠IgG2a变体：野生型mIgG2a、带有L234A/L235A/P329G(LALAPG)突变的mIgG2a、以及带有S239D/I332E(DE)突变的mIgG2a，都已知能增加ADCC。固然所有的IgG都显露出一致的连系活性，但只有DE变体对IFN-γ处理的Trp2多肽脉冲的B16F10细胞显露出ADCC申报活性，而且ADCC申报活性与mIgG2a(DE)浓度亲切相关，对折最大有效浓度约为15ng/ml(图3a)。

在没有IFN-γ和多肽脉冲的情形下，B16F10上缺乏壮大的ADCC申报活性，这突显了像很多肿瘤抗原一般，内源性表达的Trp2的低表达水平。针对Trp2/H2-Kb的高亲和力TCRm的获得可以使用全内反射荧光(TIRF)显微镜来检测B16F10细胞外观Trp2抗原的表达水平。试图在单分子水平上量化最佳ADCC所需的Trp2/H2-Kb细胞外观表达水平。为此，设计了一种带有ALFA标签的mIgG2a13 (mIgG2a13-ALFA)，使其可以用抗ALFA标记的NBs原位标记细胞外观(图3b)，它与ALFA与皮摩尔亲和力连系。凭据IFN-γ和/或Trp2肽的处理，视察到单个mIgG2a13-ALFA与细胞外观Trp2/H2-Kb连系，它们随机扩散到质膜中(图3 b,c)。经IFN-γ和Trp2多肽处理后，mIgG2a13-ALFA的细胞外观密度由未处理细胞的＜0.05μm-2增加到约0.8 μm-2。用沟通浓度的Trp2多肽进行了剂量回响实验，以滴定每个B16F10细胞表达的Trp2/H2-Kb分子的数量和可测量的ADCC申报活性。视察到，在到场Trp2后，B16F10细胞上Trp2密度随剂量的增加而增加，这与ADCC申报基因的剂量回响亲切相关。估量在+peptide/+IFN-γ前提下，ADCC所需的每个细胞最小Trp2分子数量约为1000-2000 Trp2(图3 d,e)。在没有添加多肽或IFN-γ的B16F10细胞上，估量每个细胞表达＜100 Trp2/H2-Kb分子，但IFN-γ剂量滴定使这一数字增加到约800-1000，导致适度的ADCC申报基因激活(图3 f,g)。

鉴于TCRm在诱导针对低表达肿瘤抗原的有效ADCC方面的局限性，试图索求Trp2特异性TCRm抗体的其他形式，这些模式或者更有效地限制抗原剂量。是以，生成了一个TCRm双特异性T 细胞连系器(TCRm-BiTE)，包罗Trp2/H2-Kb TCRm scFv克隆13和2C11 anti-CD3e scFv，以将T 细胞招募到肿瘤细胞(图4a)。首先证实了TCRm-BiTE能够剂量依靠的体式杀死不表达Trp2的Trp2多肽脉冲的EL4细胞，验证了TCRm-BiTE的活性(图4b)。然后，遵循在ADCC和成像试验中竖立的实验前提，在存在和/或不存在Trp2多肽和IFN-γ的情形下检测B16F10的杀伤感化。TCRm-BiTE在没有脉冲肽或IFN-γ预处理的情形下，即使在内源性前提下也示意出对B16F10细胞的强烈细胞毒活性(图4c)。还细心评估了零丁的anti-CD3e 2C11 scFv和BiTE非特异性感化，发现2C11 scFv零丁对B16F10以及多肽脉冲的EL4和MC38细胞株有微弱的杀伤感化(图4 c,d)，表明2C11能够引起某种水平的非特异性杀伤活性，与BiTE的TCRm scFv部门无关。总之，证实了TCRm-BiTE可以经由对Trp2等极低密度抗原的特异性识别而触发B16F10肿瘤细胞的细胞消融。

还索求TCRm抗体在以CAR-T形式呈现时的实用性。用scFv克隆13替代anti-CD19 CAR-T构建体中的scFv(图4e)，将其克隆到GFP+ CAR盒中，并进行了体外肿瘤杀伤实验。用scFv13 CAR转导的小鼠T 细胞与B16F10细胞以效靶比1:1、3:1和10:1孵育，DAPI染色检测B16F10细胞灭亡情形(图4f)。对B16F10细胞的杀伤从E:T=1:1起头，在没有IFN-γ处理的情形下在10:1达到最大值，这表明scFv13 CAR即使在自然低抗原密度(每个细胞＜100 分子)的情形下也能对B16F10细胞发生回响。用IFN-γ预处理B16F10细胞可进一步增加对B16F10细胞的杀伤感化。进一步证实CAR-T介导的杀伤是Trp2特异性的，因为scFv13 CAR绕过了H2-Kb+，但不克绕过Trp2-小鼠B 细胞(图4g)。总而言之，TCRm与多种免疫治疗形式兼容。

应用雷同的策略来生成基于构造的人pMHC特异性TCRm scFv文库。重点研究了HLA-A*02:01，因为它是一种常见的等位基因，而且存在几种已揭橥的TCRm抗原连系片段与p-HLA-A*02:01复合体连系的构造。选择了3M4E5 TCRm 抗体(NY-ESO1/HLA-A*02:01(PDB:3GJF))作为模板，因为它在pMHC外观上有显着的TCR-like的规范对接位置(图5a)。搜检构造后，在NY-ESO1多肽侧链的4Å内的CDR环上选择了7个残基，而忽略与MHC接触的残基(图5a)。经由使用三聚体暗码子夹杂将随机突变引入这些位置，建立了一个多样性约为2×10^8的人TCRm scFv文库。在建造文库之前，在酵母外观展示了3M4E5 scFv，以验证与NY-ESO1/ HLA-A*02:01 tetramer的连系(图5b)。

经由酵母外观展示手艺对4种已竖立的人类肿瘤抗原进行了筛选：NY-ESO1/HLA-A*02:01、MART1(A2L)/HLA-A*02:01、gp100(A9V)/HLA-A*02:01和KRAS/HLA-A*02:01 (图5 c-f)。用沟通的抗体支架从新选择了NY-ESO1，但使用新文库星散NY-ESO1的新变体，而其他三个多肽代表新的HLA-A*02:01限制性特异性。经由四轮选择后，视察到针对每个靶标pMHC的连系剂的特异性富集。酵母展示的针对每个抗原的scFv克隆与用于选择的所有pMHC的pMHC tetramer染色以评估正交性。新的TCRm克隆(表S1)与其靶标的pMHC显露出高度特异的回响性，但与非靶标的pMHC的交叉回响可忽略不计，这表明回响性取决于多肽而不是HLA-A*02:01(图5 c-f右)。纯化的重组scFv的连系亲和力显露出从个位数到两位数的KD (图S5 a-d和表S2)。

为了测试hTCRm抗体的生物学活性，选择了MART1(A2L)/HLA-A*02:01，MA2的连系。重组MA2 IgG1与MART1肽脉冲的A375人黑色素瘤细胞系连系，并与单链MART1(A2L)/HLA-A2 pMHC连系，在293 细胞上显露可忽略的配景。获得了MA2 hIgG1的Fc DLE突变体(S293D/A330L/I332E)以增加ADCC的活性。MA2 Fc DLE突变体经由ADCC对MART1多肽脉冲的A375黑色素瘤细胞的ADCC活性杀死肿瘤细胞，但保留非靶标多肽脉冲的A375细胞(图5g)，强调了MA2肽的选择性。最后，作为MA2交叉回响的严厉测试，在竖立的HLA-A*02:01酵母pMHC文库上筛选了MA2 Fab。发现，来自后几轮选择的富集肽展望MART1是来自人类卵白质组的top排名较前的成家(图5h)。固然这并纷歧定表明MA2在体内不会有一些意想不到的脱靶回响，但这是一项非常严厉的测试，表明MA2对MART1具有相当的特异性。

为了视察MA2 TCRm抗体若何识别MART1(26-35)-HLA-A*02:01，对该复合体进行了X射线结晶学剖析。MA2在虫豸细胞中以Fab形式重组表达，MART1(A2L)/HLA-A*02:01在大肠杆菌中发生的包容体中复性。在2.3-Å差别率下测定了复杂的晶体构造，表明MA2与MART1/HLA-A*02:01连系，TCR-like对接角度与其模板3M4E5相似 (图6a)，但顺时针扭转约9°，以适应与NY-ESO1与MART1的新肽接触(图6 b,c)。与具有NY-ESO1的3M4E5复合物比拟，这种扭转调整陪伴着MHC接触的净损失，但肽接触的增加。

和3M4E5与NY-ESO1/HLA-A*02:01的接触比拟，细心搜检MA2与MART1(A2L)/HLA-A*02:01接触，发现与MHC接触比拟，MA2 复合物中肽的显著富集(图6 d,e)。MA2与7个HLA-A*02:01氨基酸连系，个中R65、K146和H151占MA2/HLA-A*02:01互相感化的80%。比拟之下，14个HLA-A*02:01氨基酸与3M4E5接触，R65、Q72和Q155仅占3M4E5互相感化的50%摆布。还视察到，在MHC互相感化中完全没有MA2、CDRH-1和CDRH-2(图6c)，而它们占MHC与3M4E5互相感化的~30%(图6b)。MA2的有限MHC接触表明，与其模板3M4E5比拟，它更偏重于肽的识别，这或者是选择它时以肽为中心的文库设计的究竟。

在MA2复合体中，与MART1(26-35)肽总共26个接触中的12个是由文库中随机分布的轻链CDR1残基形成的(图6e)。个中，MA2 CDRL-1上的Q32与多肽P4、P5、P7和P8 MART1残基有11个接触。相反，3M4E5上的沟通位置Y32只与NY-ESO1肽发生1个接触。固然随机选择了轻链CDR3上的四个位置，但没有一个位置被用来接触MART1肽。这与3M4E5形成了光鲜对比，个中轻链CDR3在NY-ESO1肽识别中施展了焦点感化(图6d)。总的来说，MA2复合体的构造具有高度的揭示性，因为从新设计的3M4E5 TCRm抗体已经将其大部门的pMHC互相感化从新集中在肽上，而不是MHC(图6 f,g)。

该策略解决了今朝用于星散TCRm抗体的两个问题：第一，使用文库的从头筛选来“getting on the beach”的经典卵白质工程问题。为了筛选针对典型细胞外观靶点的拮抗剂单抗，个中很多构造方案(即靶表位)同样有效，从单抗运动中获得的产量平日很高。然而，随机筛选的TCRm抗体筛查射中率平日很低，因为TCR-like、MHC限制性的构造解决方案很少见。幼稚抗体不具有以TCR-like的体式与pMHC连系的倾向，而且更有或者连系MHC外观的替代表位。事实上，很多TCRm单抗的构造显露它们向MHC凹槽的一端倾斜、偏离或连系，在那边多肽对MHC接触的能量分布将是非幻想的。经由从具有幻想的TCR-like连系萍踪的TCRm单抗起头，能够有效地“on the beach”，并能够绕过随机的筛选过程。幸运的是，已经报道了充沛数量的TCRm Ab/pMHC复合晶体构造，个中有几种幻想的连系模式。然而，更多的复合体的构造，很轻易经由X射线结晶学获得，将极大地扩展肇端模板的列表，为更多的MHC等位基因建立MHC倾向文库。

该策略解决的第二个问题是若何提高TCRm抗体的多肽特异性。从MHC限制的TCRm抗体构造模板起头，假设只随机分列与多肽接触的残基的文库能够示意出极端的多肽选择性。事实上，星散的TCRm抗体具有很高的亲和力，而且具有很强的多肽选择性。对从新设计的MART1特异性TCRm的构造剖析表明，与NY-ESO1特异性亲本抗体比拟，该策略将其连系更多地集中在肽序列上。

TCRm抗体使我们可以对TCRm抗体有效裂解所需的肿瘤抗原的表达水平提出高度定量的问题，这些TCRm抗体的形式为IgG、BiTE和CAR-T。TCRm抗体在实现对肿瘤细胞的有效细胞毒性方面的一个潜在障碍是细胞上非pMHC抗原的低密度，而传统抗体靶向的是大量的表位(每个细胞20000-500000个)。使用单分子显微成像和alpha标记手艺来量化经典的小鼠细胞内肿瘤抗原Trp2的表达。令人诧异的是， TCRm抗体每个细胞检测到＜100的Trp2多肽分子，而且仅在每个细胞约1000 分子的情形下诱导ADCC旌旗。TCRm介导的ADCC旌旗与抗原密度之间的相关性提醒，TCRm抗体的治疗形成或者取决于肿瘤细胞上的抗原表达，如WT1 TCRm抗体【Therapeutic efficacy of an Fc-enhanced TCR-like antibody to the intracellular WT1 oncoprotein】。极低密度的pMHC(＜150拷贝)能够经由TCRs识别来激活CTL，但TCRm抗体介导的细胞毒感化或者需要比ADCC更有效的体式。值得注重的是，基于TCRm抗体的BiTE和CAR-T在生理前提下杀死肿瘤细胞的对折最大按捺浓度局限与在多肽脉冲细胞中的检测究竟相似。

基于TCRm抗体的细胞毒性能够被超低密度的细胞内肿瘤抗原触发，这一事实为这项手艺的进一步成长供应了一个令人信服的来由。事实上，该策略能够使TCRm与现有文库在短短2周内星散出针对给定MHC等位基因呈现的新靶标多肽抗原。此外，在序列保守的情形下，仍有或者设计如许的..，显露出对多个等位基因的MHC特异性，这将使遗传异质性患者群体可以更普遍地笼盖。这种加快的时间框架供应了在许可实时治疗干涉的时间局限内凭据患者特定的抗原发生TCRm抗体的或者性。

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